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联系人:亨先生
 
细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
点击次数:879 发布时间:2016-06-28
 

YIJI细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

YIJI细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到AMPK磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反应, 即采用比色法测定其氧化后峰值的变化,以分析细胞裂解样品中AMPK活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中AMPK激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

 

技术背景

 

5AMP活化蛋白激酶(5AMP activated protein kinase;AMPK)属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物,由3个亚体,α、β、γ构成:其中γ体有4个胱硫醚β合酶cystathione beta synthaseCBS)结构域,又称为巴特曼(Bateman)结构域,以探测AMP和ATP的比例;α亚体含有催化结构域,一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 复合物催化的磷酸化后,AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式,包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定:促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 XXXXXXXXXXXX基于底物XXXXXXXXXXXX,在ATP的存在下,受到5AMP活化蛋白激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其峰值的变化(340nm),来定量分析5AMP活化蛋白激酶的活性其反应方式为:

 

产品内容

 

YIJI清理液(Reagent A)   毫升

YIJI裂解液(Reagent B)   毫升

YIJI缓冲液(Reagent C)   毫升

YIJI酶促液(Reagent D)   微升

YIJI反应液(Reagent E)   微升

YIJI底物液(Reagent F)        微升

YIJI阴性液(Reagent G)   微升

产品说明书   1份

 

保存方式

 

保存YIJI清理液(Reagent A)在4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于细胞预处理

比色皿或酶标板:用于比色分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品比色分析

 

实验步骤

 

  • 待测样品准备

 

  • 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 106细胞)
  • 小心加入3毫升YIJI清理液(Reagent A,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化
  • 加入3毫升YIJI清理液(Reagent A,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升YIJI裂解液(Reagent B,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YJ30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测样品(例如组织裂解悬液等),置于冰槽里 
  • 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔5分钟,读数7次(共30分钟),并置零
  • 背景对照测定

 

  • 移取65微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入10微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入5微升YIJI阴性液(Reagent G
  • 放进30培养箱里静置2分钟
  • (选择步骤)放进分光光度仪,置零
  • (选择步骤)取出比色皿
  • 加入10微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入10微升YIJI底物液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 340波长读数30分钟 

 

  • 样品测定

 

  • 移取65微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入10微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入5微升待测样品(注意:50微克组织蛋白;样品须溶解
  • 放进30培养箱里静置2分钟
  • (选择步骤)放进分光光度仪,置零
  • (选择步骤)取出比色皿
  • 加入10微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入10微升YIJI底物液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数:340波长读数0分钟 340波长读数30分钟 

 

  • 计算样品活性

 

六、酶标板测定

 

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取65微升YIJI缓冲液(Reagent C到96孔板中
  • 分别加入10微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 分别加入5微升YIJI阴性液(Reagent G待测样品(50微克组织蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 30℃温度下孵育2分钟
  • 分别加入10微升YIJI反应液(Reagent E
  • 分别加入10微升YIJI底物液(Reagent F
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和30分钟读数
  • 活性计算:

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景操作
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 加入YIJI底物液(Reagent F后3秒内即刻比色测定
  • 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定0分钟读数高于30分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YJ30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 可以使用AMPK抑制剂(DORSOMORPHIN)作为抑制剂对照或阴性对照
  • 5AMP活化蛋白激酶活性单位浓度定义:在30温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

订购信息

 

编号 名称 规格

YJ50140.1.3 YIJI细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂 20次

YJ50140.1.3A YIJI清理液(Reagent A)     500毫升

YJ50140.1.3B YIJI裂解液(Reagent B)     100毫升

YJ50140.1.3C      YIJI缓冲液(Reagent C)      50毫升

YJ50140.1.3D YIJI酶促液(Reagent D)     5毫升

YJ50140.1.3E      YIJI反应液(Reagent E)      5毫升

YJ50140.1.3F YIJI底物液(Reagent F)     5毫升

YJ50140.1.3G YIJI阴性液(Reagent G)     5毫升

 

产品编号

名称

规格

YJ50054.1

细胞Akt1/PKBa激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50054.2

组织Akt1/PKBa激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50054.3

细胞Akt2/PKBβ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50054.4

组织Akt2/PKBβ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50054.5

细胞Akt3/PKBγ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50054.6

组织Akt3/PKBγ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50056.1

细胞ERK1/2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50056.2

组织ERK1/2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50057.1

细胞P38a激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50057.2

组织P38a激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50058.1

细胞PI3K激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50058.2

组织PI3K激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50059.1

细胞PKA激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50059.2

组织PKA激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50060.1

细胞Src激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50060.2

组织Src激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50126.1

细胞PKC激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50126.2

组织PKC激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50140.1

细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50140.2

组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50159.1

细胞ERK1激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50159.2

组织ERK1激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50159.3

细胞ERK2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50159.4

组织ERK2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50161.1

细胞GSK3α激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50161.2

组织GSK3α激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50161.3

细胞GSK3β激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50161.4

组织GSK3β激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50171.1

细胞P38β2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50171.2

组织P38β2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.1

细胞PKCα激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.2

组织PKCα激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.3

细胞PKCβ1激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.4

组织PKCβ1激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.5

细胞PKCβ2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.6

组织PKCβ2激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.7

细胞PKCγ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.8

组织PKCγ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.9

细胞PKCδ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.10

组织PKCδ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.11

细胞PKCε激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.12

组织PKCε激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.13

细胞PKCζ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.14

组织PKCζ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.15

细胞PKCη激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.16

组织PKCη激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.17

细胞PKCθ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.18

组织PKCθ激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.19

细胞PKCι激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

YJ50178.20

组织PKCι激酶活性比色法定量检测试剂盒

20次

 

 

 
 
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