BEIZHUO 纯化线粒体膜通道孔（MPTP）比色法检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 BEIZHUO 纯化线粒体膜通道孔（MPTP）比色法检测试剂是一种旨在通过比色法检测线粒体的体积（膨胀 性）变化，来实时分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心 研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膜通道孔活性的检测。产品严格无菌，即到即用，活体 检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。 技术背景 线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性 且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的诱导 开放，显著改变线粒体的通透性，小于 1500 D 的溶质可以自由进出线粒体。钙离子过度进入、线粒体谷胱 苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素 C 的释放和线粒体膜电位 的消失，触发细胞凋亡和坏死。而环胞霉素 A （cyclosporin A；CsA）、氟比嗪（trifluoperazine）和氯化镁 等则抑制膜通道孔诱导开放。使用分光光度仪（波长 540nm 或 440nm）检测线粒体的体积（膨胀性）变化， 来分析和观察线粒体膜通道孔开放状态。 产品内容 BEIZHUO 缓冲液（Reagent A） BEIZHUO 诱导液（Reagent B） BEIZHUO 抑制液（Reagent C） 产品说明书 毫升 微升 微升 1份 保存方式 保存在 4℃冰箱里，有效保证 6 月 用户自备 比色皿或 96 孔板：用于线粒体比色分析的容器 分光光度仪或酶标仪：用于线粒体比色定量分析 实验步骤 实验开始前，开启并设定好分光光度仪或酶标仪（温度为 25℃）：波长 540nm 或 440nm，间隔 30 秒测读 1 次，持续 10 分钟至 30 分钟，并置零 1 一、 诱导剂检测 1． 准备好待测的纯化线粒体样品 2． 移取 20 微升线粒体样品（总量为 200 微克）到比色皿或 96 孔板的对应孔里 3． 加入 170 微升 BEIZHUO 缓冲液（Reagent A），混匀 4． 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长 540nm 或 440nm）：获得 0 分钟初始读数（Initial A540） 5． 动态测读 1 分钟或室温下静置 1 分钟 6． 即刻加入 10 微升 BEIZHUO 诱导液（Reagent B）或用户自备的待测诱导剂，混匀（注意：可以设定 不同浓度梯度） 7． 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长 540nm或 440nm）：动态记录 10 分钟吸光值变化或设定时间点记 录实际吸光值――吸光值降低，表明诱导膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常 8． 计算吸光值比值（A540/Initial A540）：设定时间点实际吸光值/0 分钟吸光值――吸光值比值降低，表明 诱导膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常 9． 构建膜通道孔诱导开放曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X） 为时间（秒） 10． 或构建膜通道孔诱导开放-药物浓度关系曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为药物浓度 二、 抑制剂检测 1． 准备好待测的纯化线粒体样品 2． 移取 20 微升线粒体样品（总量为 200 微克）到比色皿或 96 孔酶标板的对应孔里 3． 加入 xx 微升室温预热的 BEIZHUO 缓冲液（Reagent A），混匀 4． 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长 540nm 或 440nm）：获得 0 分钟初始读数（Initial A540） 5． 动态测读 1 分钟或室温下静置 1 分钟 6． 加入 xx 微升 BEIZHUO 抑制液（Reagent C）或用户自备的待测抑制剂，混匀（注意：可以设定不同 浓度梯度） 7． 动态测读 2 分钟或室温下静置 2 分钟 8． 即刻加入 xx 微升 BEIZHUO 诱导液（Reagent B），混匀 9． 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长 540nm或 440nm）：动态记录 10 分钟吸光值变化或设定时间点记 录实际吸光值――吸光值不变，表明抑制膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常 10． 计算吸光值比值（A540/Initial A540）：设定时间实际吸光值/0 分钟吸光值――吸光值比值不变，表明抑 制膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常 11． 构建膜通道孔诱导开放曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X） 为时间（秒） 12． 或构建膜通道孔诱导开放-药物浓度关系曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为药物浓度 注意事项 1． 本产品为 20 次操作 2． 本产品用于膜通道孔的功能检测、以及诱导剂和抑制剂筛选 3． 操作时，须戴手套 4． 使用时，避免污染母液，尤其是 BEIZHUO 缓冲液（Reagent A） 2 
5． 线粒体样品中忌用磷酸盐、EDTA、钙镁离子等处理 6． 建议使用未经诱导或抑制处理的样品作为阴性对照 7． 可以动态检测 10 分钟或 30 分钟 8． 可以使用 540nm 波长的滤波器或者 440nm 波长的滤波器 9． 可以使用分光光度仪检测，0.2 毫升比色皿替代 96 孔板 10．540nm 波长的 0 分钟读数通常 0.8 为理想状态；而 440nm 波长的 0 分钟读数通常 0.2 为理想状态；其 吸光读数取决于线粒体的浓度 11．BEIZHUO 诱导液（Reagent B）加入后的任一检测时间读数低于加入前读数表明膜通道孔开放 12．如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则吸光读数缓慢降低 13．BEIZHUO 诱导液（Reagent B）含有氯化钙，用户可以使用其它诱导剂替代，例如磷酸盐，二氧化钾 等 14．BEIZHUO 抑制液（Reagent C）含有 EGTA，用户可以使用其它抑制剂替代，例如环胞素 A，ADP 等 15．本公司提供通用型膜通道孔抑制剂：BEIZHUO 0.2 毫摩尔环胞素 A（cyclosporine A）－GMS12226 16．诱导或抑制再诱导检测参考图像如下 17．本公司提供系列线粒体分析试剂产品 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定检测敏感 
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