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BEIZHUO 纯化线粒体膜通道孔(MPTP)比色法检测试剂盒产品说明书(中文版)
点击次数:612 发布时间:2014-02-25
 

BEIZHUO 纯化线粒体膜通道孔(MPTP)比色法检测试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

BEIZHUO 纯化线粒体膜通道孔(MPTP)比色法检测试剂是一种旨在通过比色法检测线粒体的体积(膨胀

性)变化,来实时分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心

研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膜通道孔活性的检测。产品严格无菌,即到即用,活体

检测,分辨率高,操作简捷,性能稳定。

技术背景

线粒体膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore;MPTP)是由线粒体内外膜成分构成的非特异性

且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时,线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的诱导

开放,显著改变线粒体的通透性,小于 1500 D 的溶质可以自由进出线粒体。钙离子过度进入、线粒体谷胱

苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放,而造成细胞色素 的释放和线粒体膜电位

的消失,触发细胞凋亡和坏死。而环胞霉素 (cyclosporin A;CsA)、氟比嗪(trifluoperazine)和氯化镁

等则抑制膜通道孔诱导开放。使用分光光度仪(波长 540nm 或 440nm)检测线粒体的体积(膨胀性)变化,

来分析和观察线粒体膜通道孔开放状态。

产品内容

BEIZHUO 缓冲液(Reagent A)

BEIZHUO 诱导液(Reagent B)

BEIZHUO 抑制液(Reagent C)

产品说明书

毫升

微升

微升

1

保存方式

保存在 4℃冰箱里,有效保证 6 月

用户自备

比色皿或 96 孔板:用于线粒体比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪:用于线粒体比色定量分析

实验步骤

实验开始前,开启并设定好分光光度仪或酶标仪(温度为 25℃):波长 540nm 或 440nm,间隔 30 秒测读 1

次,持续 10 分钟至 30 分钟,并置零

1

 

一、 诱导剂检测

1. 准备好待测的纯化线粒体样品

2. 移取 20 微升线粒体样品(总量为 200 微克)到比色皿或 96 孔板的对应孔里

3. 加入 170 微升 BEIZHUO 缓冲液(Reagent A),混匀

4. 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长 540nm 或 440nm):获得 分钟初始读数(Initial A540)

5. 动态测读 分钟或室温下静置 分钟

6. 即刻加入 10 微升 BEIZHUO 诱导液(Reagent B)或用户自备的待测诱导剂,混匀(注意:可以设定

不同浓度梯度)

7. 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长 540nm或 440nm):动态记录 10 分钟吸光值变化或设定时间点记

录实际吸光值――吸光值降低,表明诱导膜通道孔开放活性(MPTP)增强,即膜通道孔功能正常

8. 计算吸光值比值(A540/Initial A540):设定时间点实际吸光值/0 分钟吸光值――吸光值比值降低,表明

诱导膜通道孔开放活性(MPTP)增强,即膜通道孔功能正常

9. 构建膜通道孔诱导开放曲线:纵座标(Y)为实际吸光值或吸光值比值(A540/Initial A540),横座标(X)

为时间(秒)

10. 或构建膜通道孔诱导开放-药物浓度关系曲线:纵座标(Y)为实际吸光值或吸光值比值(A540/Initial

A540),横座标(X)为药物浓度

二、 抑制剂检测

1. 准备好待测的纯化线粒体样品

2. 移取 20 微升线粒体样品(总量为 200 微克)到比色皿或 96 孔酶标板的对应孔里

3. 加入 xx 微升室温预热的 BEIZHUO 缓冲液(Reagent A),混匀

4. 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长 540nm 或 440nm):获得 分钟初始读数(Initial A540)

5. 动态测读 分钟或室温下静置 分钟

6. 加入 xx 微升 BEIZHUO 抑制液(Reagent C)或用户自备的待测抑制剂,混匀(注意:可以设定不同

浓度梯度)

7. 动态测读 分钟或室温下静置 分钟

8. 即刻加入 xx 微升 BEIZHUO 诱导液(Reagent B),混匀

9. 即刻放进分光光度仪或酶标仪(波长 540nm或 440nm):动态记录 10 分钟吸光值变化或设定时间点记

录实际吸光值――吸光值不变,表明抑制膜通道孔开放活性(MPTP)增强,即膜通道孔功能正常

10. 计算吸光值比值(A540/Initial A540):设定时间实际吸光值/0 分钟吸光值――吸光值比值不变,表明抑

制膜通道孔开放活性(MPTP)增强,即膜通道孔功能正常

11. 构建膜通道孔诱导开放曲线:纵座标(Y)为实际吸光值或吸光值比值(A540/Initial A540),横座标(X)

为时间(秒)

12. 或构建膜通道孔诱导开放-药物浓度关系曲线:纵座标(Y)为实际吸光值或吸光值比值(A540/Initial

A540),横座标(X)为药物浓度

注意事项

1. 本产品为 20 次操作

2. 本产品用于膜通道孔的功能检测、以及诱导剂和抑制剂筛选

3. 操作时,须戴手套

4. 使用时,避免污染母液,尤其是 BEIZHUO 缓冲液(Reagent A)

2

 

5. 线粒体样品中忌用磷酸盐、EDTA、钙镁离子等处理

6. 建议使用未经诱导或抑制处理的样品作为阴性对照

7. 可以动态检测 10 分钟或 30 分钟

8. 可以使用 540nm 波长的滤波器或者 440nm 波长的滤波器

9. 可以使用分光光度仪检测,0.2 毫升比色皿替代 96 孔板

10.540nm 波长的 分钟读数通常 0.8 为理想状态;而 440nm 波长的 分钟读数通常 0.2 为理想状态;其

吸光读数取决于线粒体的浓度

11.BEIZHUO 诱导液(Reagent B)加入后的任一检测时间读数低于加入前读数表明膜通道孔开放

12.如果膜通道孔为瞬时开放(transient),则吸光读数缓慢降低

13.BEIZHUO 诱导液(Reagent B)含有氯化钙,用户可以使用其它诱导剂替代,例如磷酸盐,二氧化钾

14.BEIZHUO 抑制液(Reagent C)含有 EGTA,用户可以使用其它抑制剂替代,例如环胞素 A,ADP 

15.本公司提供通用型膜通道孔抑制剂:BEIZHUO 0.2 毫摩尔环胞素 A(cyclosporine A)-GMS12226

16.诱导或抑制再诱导检测参考图像如下

17.本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感

 

 
 
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