YIJI组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版) 主要用途 YIJI组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到 AMPK磷酸化后,进而 由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生 ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应,即采用比色法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析组织裂解样品中AMPK活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中 AMPK 激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。 技术背景 5’AMP活化蛋白激酶(5’AMP activated protein kinase;AMPK)属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonineprotein kinase)家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物,由3个亚体,α、β、γ构成:其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶(cystathione beta synthase;CBS)结构域,又称为巴特曼(Bateman)结构域,以探测AMP和ATP的比例;α亚体含有催化结构域,一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 复合物催化的磷酸化后,AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式,包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定:促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 LKKLTRASFFGQ。基于底物LKKLTRASFFGQ,在ATP的存在下,受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其峰值的变化(340nm),来定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反应方式为: 产品内容 YIJI清理液(Reagent A) YIJI裂解液(Reagent B) YIJI缓冲液(Reagent C) YIJI酶促液(Reagent D) YIJI反应液(Reagent E) YIJI底物液(Reagent F) YIJI阴性液(Reagent G) 保存方式 保存 YIJI清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻 融;有效保证6月 1 用户自备 AMPK激酶:用于抑制剂筛选 1.5毫升离心管:用于样品保存的容器 15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器 (微型)台式离心机:用于细胞预处理 比色皿或酶标板:用于比色分析操作的容器 分光光度仪或酶标仪:用于样品比色分析 实验步骤 一、 待测样品准备 1. 手术取出动物组织,并秤重 500毫克组织重量 2. (选择步骤)放进预冷的 15毫升锥形离心管 3. (选择步骤)加入 毫升 YIJI清理液(Reagent A)清洗 4. (选择步骤)抽去清理液 5. 移入到一个液氮冻存管 6. 即刻放进液氮罐放置一夜 7. 次日从液氮罐里取出,即刻(zui快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融) 8. 放进一个 15毫升锥形离心管 9. 加入置于冰槽里的 微升 YIJI裂解液(Reagent B) 10.强力涡旋震荡 30秒,充分混匀 11.放进冰槽里孵育 30分钟,期间每 10分钟强力涡旋震荡 30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱 里储存备用) 12.即刻放进 4℃台式离心机离心 10分钟,速度为 10000g 13.小心移取上清液到新的无菌的 1.5毫升离心管 14.移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 YIJI Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒- YJ30030.1) 15.放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用 二、 测定准备 1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里 2. 设定好分光光度仪(温度为 30℃):波长为 340nm,间隔 1分钟,读数 6次(共 5分钟),并置零 三、 背景对照测定 1. 移取 2. 加入 3. 加入 微升 YIJI缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 微升 YIJI酶促液(Reagent D) 微升 YIJI阴性液(Reagent G) 4. 放进 30℃培养箱里静置 2分钟 5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零 6. (选择步骤)取出比色皿 2 7. 加入 8. 加入 微升 YIJI反应液(Reagent E) 微升 YIJI底物液(Reagent F) 9. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3秒之内) 10.即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数 0分钟 -340波长读数 5分钟 四、 样品测定 1. 移取 2. 加入 微升 YIJI缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 微升 YIJI酶促液(Reagent D) 3. 加入 5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解悬液蛋白;样品须溶解) 4. 放进 30℃培养箱里静置 2分钟 5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零 6. (选择步骤)取出比色皿 7. 加入 8. 加入 微升 YIJI反应液(Reagent E) 升 YIJI底物液(Reagent F) 9. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3秒之内) 10.即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数:340波长读数 0分钟 -340波长读数 5分钟 五、 计算样品活性 单位=微摩尔 NADH/分钟 六、酶标板测定 1. 在 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品 2. 分别移取 3. 分别加入 微升 YIJI缓冲液(Reagent C)到 96孔板中 微升 YIJI酶促液(Reagent D) 4. 分别加入 5微升 YIJI阴性液(Reagent G)或待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔 中(注意:样品须清澈) 5. 轻轻摇动 96孔酶标板 6. 在 30℃温度下孵育 2分钟 7. 分别加入 8. 分别加入 微升 YIJI反应液(Reagent E) 微升 YIJI底物液(Reagent F) 9. 轻轻摇动酶标板 10.即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和 5分钟读数 11.活性计算: 单位=微摩尔 NADH/分钟 七、抑制剂筛选 3 1. 在 96孔酶标板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品 2. 按下表加入试剂 内容物 样本背景 微升 完全酶活性 微升 待测抑制剂酶活性 微升 YIJI缓冲液 (Reagent C) YIJI阴性液 (Reagent G) 待测抑制剂 微升 —— —— 微升 —— ―― 微升 用户自备的纯化酶 96孔板每孔总量 微升(1毫单位) 完全活性孔 ( 微升) 微升(1毫单位) 待测抑制剂样品孔 ( 微升) 样本背景孔 ( 微升) 3. 轻轻摇动酶标板,混匀 4. 放进 30℃培养箱里静置 30分钟 5. 分别加入 6. 分别加入 7. 分别加入 微升 YIJI酶促液(Reagent D) 微升 YIJI反应液(Reagent E) 微升 YIJI底物液(Reagent F) 8. 轻轻摇动酶标板 9. 即刻放进酶标仪检测:获得初始吸光读数(OD) 10.放进 30℃培养箱里孵育 30分钟 11.即刻放进酶标仪检测:获得终点吸光读数(OD) 12.实际吸光读数:初始吸光读数(OD)—终点吸光读数(OD) 13.抑制活性计算: 1) 2) IC50:50%抑制率所需的抑制剂浓度 3) 直接构建抑制曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数 OD;横座标(X轴)为已知抑制剂浓度 注意事项 1. 本产品为 25次操作,包括背景操作 2. 操作时,须戴手套 3. 系统操作过程中,背景测定只需 1次 4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 5. 样品须澄清,至关重要 6. 加入 YIJI底物液(Reagent F)后 3秒内即刻比色测定 7. 测定值由高到低变化;测定可持续 30分钟 8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底 9. 样本测定 0分钟读数高于 5分钟读数表明具有酶活性 10.建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/5 微升(本公司提供 YIJI Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒- YJ30030.1) 11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度 4
12.可以使用 AMPK抑制剂(DORSOMORPHIN)作为抑制剂对照或阴性对照 13.5’AMP活化蛋白激酶活性单位浓度定义:在 30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化 1微摩尔 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位 14.本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品 质量标准 1 .本产品经鉴定性能稳定 2 .本产品经鉴定检测敏感 |