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组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒
点击次数:2028 发布时间:2016-06-28

         YIJI组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

YIJI组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到  AMPK磷酸化后,进而

由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生 ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应,即采用比色法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析组织裂解样品中AMPK活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中 AMPK  激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

技术背景

5’AMP活化蛋白激酶(5’AMP activated protein kinaseAMPK)属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonineprotein kinase)家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物,由3个亚体,α、β、γ构成:其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶(cystathione beta synthaseCBS)结构域,又称为巴特曼(Bateman)结构域,以探测AMPATP的比例;α亚体含有催化结构域,一旦收到AMPKKLKB1/MO25/STRAD  复合物催化的磷酸化后,AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式,包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定:促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为  LKKLTRASFFGQ基于底物LKKLTRASFFGQ,在ATP的存在下,受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinasePK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenaseLDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其峰值的变化(340nm),来定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反应方式为:

产品内容

YIJI清理液(Reagent  A

YIJI裂解液(Reagent  B

YIJI缓冲液(Reagent  C

YIJI酶促液(Reagent  D

YIJI反应液(Reagent  E

YIJI底物液(Reagent  F

YIJI阴性液(Reagent  G

保存方式

保存 YIJI清理液(Reagent  A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻

融;有效保证6月

1

 

 

 

用户自备

AMPK激酶:用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

(微型)台式离心机:用于细胞预处理

比色皿或酶标板:用于比色分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品比色分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1. 手术取出动物组织,并秤重 500毫克组织重量

2. (选择步骤)放进预冷的 15毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入

毫升 YIJI清理液(Reagent  A)清洗

4. (选择步骤)抽去清理液

5. 移入到一个液氮冻存管

6. 即刻放进液氮罐放置一夜

7. 次日从液氮罐里取出,即刻(zui快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)

8. 放进一个 15毫升锥形离心管

9. 加入置于冰槽里的

微升 YIJI裂解液(Reagent  B

10.强力涡旋震荡 30秒,充分混匀

11.放进冰槽里孵育 30分钟,期间每  10分钟强力涡旋震荡  30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱

里储存备用)

12.即刻放进 4℃台式离心机离心 10分钟,速度为   10000g

13.小心移取上清液到新的无菌的 1.5毫升离心管

14.移取  10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用      YIJI   Bradford  蛋白质浓度定量试剂盒-

YJ30030.1

15.放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里

2. 设定好分光光度仪(温度为 30℃):波长为 340nm,间隔 1分钟,读数  6次(共  5分钟),并置零

三、 背景对照测定

1. 移取

2. 加入

3. 加入

微升 YIJI缓冲液(Reagent  C)到新的比色皿

微升 YIJI酶促液(Reagent  D

微升 YIJI阴性液(Reagent  G

4. 放进 30℃培养箱里静置 2分钟

5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

6. (选择步骤)取出比色皿

2

 

 

 

7. 加入

8. 加入

微升 YIJI反应液(Reagent  E

微升 YIJI底物液(Reagent  F

9. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数   0分钟 340波长读数   5分钟

四、 样品测定

1. 移取

2. 加入

微升 YIJI缓冲液(Reagent  C)到新的比色皿

微升 YIJI酶促液(Reagent  D

3. 加入 5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解悬液蛋白;样品须溶解)

4. 放进 30℃培养箱里静置 2分钟

5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

6. (选择步骤)取出比色皿

7. 加入

8. 加入

微升 YIJI反应液(Reagent  E

YIJI底物液(Reagent  F

9. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数:340波长读数   0分钟 340波长读数   5分钟

五、 计算样品活性

单位=微摩尔 NADH/分钟

六、酶标板测定

1. 在 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品

2. 分别移取

3. 分别加入

微升 YIJI缓冲液(Reagent  C)到 96孔板中

微升 YIJI酶促液(Reagent  D

4. 分别加入 5微升  YIJI阴性液(Reagent   G)或待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔

中(注意:样品须清澈)

5. 轻轻摇动 96孔酶标板

6. 在 30℃温度下孵育 2分钟

7. 分别加入

8. 分别加入

微升 YIJI反应液(Reagent  E

微升 YIJI底物液(Reagent  F

9. 轻轻摇动酶标板

10.即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和  5分钟读数

11.活性计算:

单位=微摩尔 NADH/分钟

七、抑制剂筛选

3

 

 

 

1. 在 96孔酶标板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品

2. 按下表加入试剂

内容物

样本背景

微升

完全酶活性

微升

待测抑制剂酶活性

微升

YIJI缓冲液

Reagent C

YIJI阴性液

Reagent G

待测抑制剂

微升

——

——

微升

——

――

微升

用户自备的纯化酶

96孔板每孔总量

微升(1毫单位)

完全活性孔

(  微升)

微升(1毫单位)

待测抑制剂样品孔

(  微升)

样本背景孔

(  微升)

3. 轻轻摇动酶标板,混匀

4. 放进 30℃培养箱里静置 30分钟

5. 分别加入

6. 分别加入

7. 分别加入

微升 YIJI酶促液(Reagent  D

微升 YIJI反应液(Reagent  E

微升 YIJI底物液(Reagent  F

8. 轻轻摇动酶标板

9. 即刻放进酶标仪检测:获得初始吸光读数(OD

10.放进 30℃培养箱里孵育 30分钟

11.即刻放进酶标仪检测:获得终点吸光读数(OD

12.实际吸光读数:初始吸光读数(OD)—终点吸光读数(OD

13.抑制活性计算:

1)

2)

IC5050%抑制率所需的抑制剂浓度

3) 直接构建抑制曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数  OD;横座标(X轴)为已知抑制剂浓度

注意事项

1. 本产品为 25次操作,包括背景操作

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需 1

4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5. 样品须澄清,至关重要

6. 加入 YIJI底物液(Reagent  F)后 3秒内即刻比色测定

7. 测定值由高到低变化;测定可持续 30分钟

8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底

9. 样本测定 0分钟读数高于  5分钟读数表明具有酶活性

10.建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/5 微升(本公司提供 YIJI  Bradford  蛋白质浓度定量试剂盒-

YJ30030.1

11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

4

 

 

 

12.可以使用 AMPK抑制剂(DORSOMORPHIN)作为抑制剂对照或阴性对照

135’AMP活化蛋白激酶活性单位浓度定义:在  30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化  1微摩尔

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位

14.本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

1 .本产品经鉴定性能稳定

2 .本产品经鉴定检测敏感

 

 
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